Metode fluorimetrice

Pe parcursul perioadei dintre absorbtie si emisie (de aproximativ 10-9 secunde), moleculele pierd o parte din energia lor prin relaxare vibrationala, astfel ca, lumina emisa are o energie mai mica decat cea excitanta si in consecinta o lungime de unda mai mare ca aceasta.
Metodele fluorimetrice sunt mai sensibile decat cele spectrofotometrice, putand decela concentratii foarte mici dintr-o substanta fluorescenta. Toti compusii fluorescenti absorb lumina la lungimea de unda de excitare.

Acest lucru inseamna ca intensitatea luminii incidente (I0) scade exponential pe masura ce raza strabate solutia compusului fluorescent. Astfel, relatia intre emisia de fluorescenta (It) si concentratia substantei fluorescente (c) este neliniara, fiind de forma:
It = I0Qf(1-10εcl)Qf fiind fractia constanta din energia luminii absorbita de compusul fluorescent.

In practica relatia dintre fluorescenta, masurata cu ajutorul unui fluorimetru, si concentratie este mult mai complexa. Atunci cand absorbanta solutiei la lungimea de unda la care se face excitarea este mare, partea din solutie care emite cel mai puternic este cea care se afla cel mai aproape de sursa de lumina, orientarea acesteia in cuva nepermitand detectia luminii emise. De aceea experimentele de determinari fluorimetrice trebuie sa inceapa cu

observarea fluorescentei din cuva cu capacul aparatului deschis, la diferite lungimi de unda (ochii si piekea nu trebuie expuse la lungimi de unda mai mici de 320 nm). Avand in vedere ca, emisia de fluorescenta se produce in toate directiile, detectorul fluorimetrului este setat pentru a colecta doar lumina emisa sub un unghi de 900 fata de raza incidenta. Reprezentarea fluorescentei in functie de concentratia metiumbeliferonei (umbeliferona este 7-hidroxicumarina, substanta puternic fluorescenta):